通蔚生物關(guān)于ELISA試劑盒樣本值低于空白值的問題介紹

在ELISA試劑盒實驗中，樣本值低于空白值是一個經(jīng)常性的問題。當(dāng)樣本值較低接近試劑盒的靈敏度就容易發(fā)生樣本值低于空白值的現(xiàn)象，特別是在血清和血漿樣本的檢測。究其原因，主要在于兩個方面，一方面是誤差，另一方面是基質(zhì)效應(yīng)。下文逐個分析不同影響因素的原理、和解決方案。

一、誤差Error
誤差分為三類，系統(tǒng)誤差、隨機誤差和過失誤差。這三類誤差中，系統(tǒng)誤差對樣本值和空白值之間的差異無影響。ELISA試劑盒樣本值低于空白值在誤差方面主要來源于隨機誤差和過失誤差。
1、隨機誤差RandomError
無法控制的變因，使測量值產(chǎn)生隨機分布的誤差，服從統(tǒng)計學(xué)這的正態(tài)分布。從統(tǒng)計學(xué)這來看，測量值有%的置信限在±3SD之間，如果CV值是20%，隨機誤差的邊界就是±120%，也就是說在CV值20%的狀況下，樣本值低于空白值120%之內(nèi)，有可能是隨機誤差的影響，特別是空白值只有一個值時。
隨機誤差不可消除，只能通過多次測量獲得的均值盡量逼近真值。降低隨機誤差的解決方案1是增加空白值的重復(fù)數(shù)量，一般認(rèn)為空白值重復(fù)10次，測量均值接近真值。
方案2是提高實驗技能，也能夠有效降低隨機誤差的影響。如果CV值在9%，樣本值趨近于零時，在統(tǒng)計這樣本值將不會低于空白值9%。
2、過失誤差GrossError
過失誤差主要是由于測量者的疏忽，犯了不應(yīng)有的錯誤造成的。過失誤差是可以避免的。針對于ELISA試劑盒樣本值低于空白值的問題，過失誤差產(chǎn)生的原因多數(shù)來源于空白孔HRP的重復(fù)加樣或污染或洗滌不干凈，造成空白值偏高，相對比來說，樣本值低于空白值。解決方案就是重復(fù)實驗，規(guī)范操作。
二、基質(zhì)效應(yīng)MatrixEffect
分析中，基質(zhì)指的是樣本中被分析物之外的組分，基質(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)。ELISA試劑盒試劑盒在開發(fā)過程中，標(biāo)準(zhǔn)品不能采用人或動物血清、血漿作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋液，只能采用其模擬物。模擬物與被測樣本在蛋白豐度、復(fù)雜性、pH等因素都會存在差異。當(dāng)樣本的基質(zhì)與其模擬物相比，降低抗原抗體的結(jié)合，便產(chǎn)生了樣本值低于空白值的現(xiàn)象。造成樣本值無法計算出數(shù)值，或者數(shù)值為負(fù)。
目前常用的去除基質(zhì)效應(yīng)的方法是，通過已知分析物濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，同時盡可能保持樣本中的基質(zhì)不變，建立一個校正曲線(CalibrationCurve)。
當(dāng)單個樣本或少量樣本值低于空白值時，可能是誤差原因，這時應(yīng)增加重復(fù)，提高操作技能。當(dāng)大量樣本都低于空白值時，應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響，建立校正曲線予以修正。
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